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DT40細胞株

2020/04/26 23:42:37 發布廠商:上海佰曄生物科技中心 >> 進入該公司展臺 已瀏覽:

佰曄中心的細胞培養服務,已經成為我司的龍頭產業。從源頭上把控細胞品質,所有黑膠蟲、支原體感染都不存在。給您一個高度還原的實驗。

DT40細胞株

細胞培養注意事項(入門級)

總的原則:無菌操作、保證DT40細胞株細胞培養環境的穩定性

按時間順序整理

1、 DT40細胞株細胞房和生物安全柜(或超凈工作臺)先開紫外照射30min。作用:對環境滅菌(空氣)。(備注:如果著急,至少也要開15分鐘)

在做實驗之前考慮好需要哪些物品。開始照射之前,將所需要用到的物品都放到生物安全柜(或超凈工作臺)里面。

常用移液槍或電動移液器等,需要在工作臺上放置一套專用設備。

細胞培養箱一般都已經調整好。定期留意一下二氧化碳是否足夠。不夠及時更換。


2、 顯微鏡需要定期消毒酒精擦拭。注意:顯微鏡一般都放在細胞房。


3、 進入實驗之前,首先給自己帶上拖鞋、頭套,口罩,實驗服,手套(手套帶雙層)。注意:手套要將袖口套進去。實驗服、拖鞋*是細胞房專用。


4、 開始操作之前先觀察DT40細胞株細胞。

首先觀察細胞培養液的顏色。現在的細胞培養液通常都放有酸堿指示劑(絕大部分是酚紅)。細胞在培養生長過程中,不斷在培養液上清中累積酸性物質,時間長了,培養液變為黃色(同時培養液中營養物質耗盡)。

其次鏡下觀察DT40細胞株細胞的生長狀態是否良好,是否需要傳代。如果生長狀態不好,需要對培養液進行調整(一般是加大血清濃度)。過于密集出現大片融合或太密集而導致細胞脫落,則進行傳代。

如果長勢良好,且細胞培養液顏色未發生變化,可以酌情進行1/2、 1/3、1/4換液,也可以全換液。總之,視細胞生長情況而定。

DT40細胞株

5、 DT40細胞株細胞培養預準備:

首先是準備各種溶液。

*是配制溶液過程中要用到的水。水用純水,高壓滅菌之后,再去內毒素。去內毒素方法很多,*簡單可以放在烘箱180度3小時。或者過去內毒素的柱子后,高壓滅菌。

第二,各種溶液滅菌:

抗生素用去內毒素水配制后,直接過濾除菌(過0.22u濾頭)。可以用一次性無菌注射器過一次性0.22u濾頭。

現在用的培養液,如果是商業化液體培養基,不用處理。如果是粉末,需要用去內毒素水在生物安全柜(或超凈工作臺)進行配制,再過濾除菌。可以先配濃縮液(如10×),過濾除菌后。再用滅菌去內毒素水稀釋成1×培養液。

第三,完全培養液的配制:

培養液加上合適比例的血清即可。但血清一般保存于-20℃,一般解凍是放在4℃冰箱解凍,耗時長,而且必須解決完全之后,才能進行完全培養基的配制。所以要提前幾個小時就將血清從-20℃轉入4℃,以期完全解凍。當然如果這一次就需要用完的話(是指用這些血清配制的培養液都用完),也可以放到37℃解凍。

第四,*重要的是保證過程中無菌。

液體必須要分裝。無論過程中用到的培養液、胰酶、血清、PBS、生理鹽水、抗生素盡量分裝。分裝是為了防止污染。如果操作有誤,僅能威脅到其中一支,而非整個。

培養液、血清、PBS、生理鹽水分裝為20mL、50mL或100mL/管

胰酶、抗生素可分裝為1mL/管。

分裝*先于DT40細胞株細胞操作

第五,操作之前,培養液先放到37度的細胞培養箱里復溫。原因:盡量減少對細胞的刺激。低溫對于細胞也是一個刺激因素。

第六,操作之前,大腦先過一遍此次操作所需要用到的所有用具。將所有用具先放到無菌臺面上。減少拿入拿出的動作,保證無菌。(如果萬一發現少拿了什么,也不要緊,再加上就是。如果是槍頭盒、移液管等用具,*先用消毒酒精噴一下)。

第七,操作之前,帶著的手套先噴消毒酒精。然后再進入工作臺。等一分鐘,等手套上的酒精揮發之后再進行操作。

DT40細胞株

6、 DT40細胞株細胞培養操作過程:

注意無菌。無論哪一管液體,開蓋后盡量立即關上(如果有幾瓶都需要開的,也注意,可以虛蓋)。蓋子向上放。操作時不要從開蓋的容器上方經過。另外,無菌臺面上擺放的各種東西,*是一字擺開,平行于自己。盡量不要前后重疊。

DT40細胞株細胞操作中所用的所有耗材試劑*都是細胞培養專用。一般都以一次性耗材居多。1ML槍頭為加長型專用培養槍頭。移液管亦有專用10mL一次性無菌移液管

(1)細胞換液:

培養皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養液,加入新培養液。

(2)細胞傳代:

傳代之前先觀察,細胞是否密集,是否開始融合。一般融合達到70-80%就可以傳代。早點傳代也可以。

如果是貼壁生長的細胞:

1) 培養皿/瓶用槍頭或移液管吸去原培養液;

2) 無菌PBS或無菌生理鹽水洗滌3次(按培養體積加入);

3) 加入適量胰酶消化適當時間(一般胰酶為0.25%;9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶,一次加入1mL胰酶。消化時間視細胞類型等多種情況綜合考慮,一般如果是細胞株,非原代培養,消化1-2分鐘足矣);

4) 用槍頭吹打數十次(視細胞類型而定。一般細胞株30-50次吧,耗時一般2分鐘左右);

5) 加入適量體積完全培養基終止胰酶消化(如果是9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶,可以加入1mL完全培養基;現在培養瓶(皿)里有2mL溶液)。

6) 現在可以將溶液進行分瓶(2mL)。如果是細胞株,直接均分到兩個培養瓶(皿)里。如果是原代培養,可以根據消化時間來對細胞進行分離;因此可以將溶液(2mL)都轉入新的培養瓶(皿)。

7) 將兩個培養瓶(皿)補足完全培養基到正常體積(果是9cm/10cm培養皿和25cm培養瓶,為5mL完全培養液)

8) 鏡下觀察。剛剛傳代細胞還沒貼壁,懸浮在溶液中,呈圓形。一般2h之內會貼壁,如果已經貼壁,根據細胞類型有不同的形態,但通常都不是圓形。

9) 鏡下觀察無誤之后,再放入細胞培養箱。培養瓶(皿)放入之前,可以用消毒酒精先擦一下。

10) 傳代之后,*第二天細胞換液一次。當然,也可以視情況而定。


7、 收拾工作臺。物品歸位,倒出垃圾。再開紫外照射30min

DT40細胞株

8、 DT40細胞株其它注意事項:

*,經常觀察。*是每天都顯微鏡下看一看,確定細胞狀態。然后該換液換,該傳代傳,不用理會的就原樣放回去。如果好幾天都不想理會,可以放不完全培養基,或者低血清濃度的培養液,維持細胞生存,但不增殖。

第二,是否加抗生素。這個視情況而定。細胞培養過程中,是要求盡量少添加不相關的雜質。抗生素對于細胞來說,也是一種負擔。但如果環境比較污染,直接添加好了。好比沒病不用吃藥,感冒了還是要吃藥;嬰兒沒病但還是要打疫苗。

第三,胎牛血清的解凍。血清一般保存于-20℃,要放在4℃冰箱解凍,耗時長,500mL要好幾個小時,我們經常是頭天離開實驗室之前放到4℃冰箱,*。所以經常分裝成10mL或者20mL。這樣,上午放到4℃冰箱,下午就可以用了。

第二,是否一定要細胞房。以及是否要完全嚴格的遵守種種器具專用。這個吧,見仁見智。凡所有種種措施及設備都是為了保證培養操作過程中無菌,減少感染的機率;專用試劑耗材保證無菌無內毒素。細胞房也是這么一個措施而已,其它試劑耗材也是;我們沒有專門的細胞房也這么養。

并不是說走夜路就一定會遇到鬼,當然走多了遲早遇到,如果總是遇不到,這個人運氣一定很好——可以去買彩票。

剛開始我們實驗室也是沒有專用的生物安全柜和細胞房,拖鞋什么的也沒辦法專用,沒有加抗生素,照樣養得好好的。但是,交叉養,還是需要注意,一是時間上分隔開來:每天細胞培養先操作。其它細菌之類操作靠后,且操作后消毒酒精臺面消毒,紫外照射1小時。二是其它操作要小心,避免帶入污染。當然,如果有必要加抗生素,還是盡早加,比細胞污染了再去搶救要來得好。

(算是順便整理了一下,屬于入門級別的。)

DT40細胞株

@geraldorjerry:你好,你的意思是紫外線照過之后,實驗操作開始了,如果萬一發現少拿了什么,就直接酒精噴一下再放進去是嗎

@llh1245:有時確實是忘記,*怕的就是那種實驗已經做到一半忘記了的,或者發現東西不夠用的。我們一般是這樣處理:耗材、移液槍還有金屬器皿之類的,可以噴一下酒精放進來,等酒精風干一下,注意不要和其它東西混雜。反正一般細胞專用的也有外包裝,里面已經是無菌無內毒素。如果是試劑,那就是直接從冰箱拿出來放進來就是。(如果只是實驗還沒有真的開始,把漏掉的東西加上,再照30分鐘就是。)


@姚麗佳:請問DT40細胞株傳代前,經過胰酶處理后,加了培養基后不用離心直接分瓶嗎?那后面培養的時候不就含有胰蛋白酶了嗎?不會產生影響嗎?

@llh1245:是的,不用離心直接分瓶。之后加入含血清的培養基中止了胰酶作用。如果是貼壁細胞,一般第二天就貼壁了。分瓶后第二天再全部換液。如果是半懸浮細胞,一般都不用胰酶消化,都是直接吹下來。

DT40細胞株

1.【無菌環境】 在DT40細胞株細胞實驗之前要注意無菌環境的建立,紫外殺毒滅菌,酒精消毒都是十分有必要的。

2.【鏡下檢查】 鏡下檢查結果非常重要,鏡檢的結果非常重要,要根據你自己的觀察進行細胞密度的識別,從而進行細胞傳代比例的確定,進行更好的細胞數量的控制,如果實驗要求比較高,需要細胞計數板計數。

3.【過火焰】

記住,所有開瓶的東西都要進行過酒精燈外焰,瞬間高溫進行灰塵的固定。這樣會大大減少染菌幾率。

4.【移液工具】

很多人對于移液工具都有偏好,不好說什么就是正確的。但是從無菌角度。使用移液管比微量移液槍減少污染的幾率要高。希望大家能用移液管。

5.【交叉污染】

混勻細胞懸液和移取培養基以及血清的工具要分開;還有就是胰酶和血清也要嚴格分開,否則容易造成交叉感染,使細胞增加染菌幾率。

?DT40細胞株
6.【消化時間】

對于貼壁細胞,我想要大家注意的是胰酶消化時間,對于常用0.25%的胰酶*把消化時間控制在30s內,必要是*鏡檢看一下是否脫壁。但是這是一個經驗活,要多積累經驗。

7.【細胞混勻】

DT40細胞株細胞的混勻要輕柔,氣泡的產生對細胞的狀態是有影響的,希望大家注意。另外,貼壁細胞容易粘連,所以要多吹打幾次。

SW 1088:http://www.mshulan.com/Home/News/data_detail/id/684465356.html

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